Dietro richiesta del Sovrano, il Sommo Pontefice Pio IV, con Breve His, quae Pro Religionis Propagatione, del 1 febbraio 1562, confermava l'istituzione dell'Ordine Religioso - Militare, ponendolo sotto la regola di San Benedetto.

Il successivo 15 marzo, nella Chiesa Primaziale di Pisa, nel corso di una grandiosa cerimonia, il Nunzio Apostolico, mons. Cornaro, consegnò a Cosimo I gli Statuti dell'Ordine approvati dal Santo Padre , conferendogli altresì il Gran Magistero dell'Ordine, nella qualità di Capo della dinastia.

L'Ordine, agli inizi, comprendeva le seguenti classi cavalleresche :

I Militi erano poi suddivisi in Commendatori se preposti all'amministrazione di commende, mentre i Serventi si classificavano in Serventi d'arme e di ufficio.

Per essere ammessi nell'Ordine, nella classe dei Militi o Cavalieri di Giustizia, bisognava produrre le prove di nobiltà, la pronuncia dei voti di Religione e l' impegno ad effettuare servizio nelle galee dell'Ordine per un minimo di tre anni.

Inoltre era prevista una tassa di ammissione che variava ,nell'ammontare, per le classi di Cavaliere di Giustizia o Milite, Cappellano e Frate Servente.

L'Ordine partecipò alla battaglia di Lepanto con dodici galee, conquistando la Bandiera fiamma della nave di Alì Pascià, comandante dell'armata di Selim II e coprendosi così di gloria.

I legni della milizia stefaniana percorsero i mari, in difesa della cristianità, assieme alle galee dei Cavalieri di San Giovanni, di San Lazzaro, della Santa Sede, di Venezia e della Spagna.

L'Ordine disponeva come, base navale, di Portoferraio, ed in seguito del porto di Livorno.

Le cariche dell'Ordine comprendevano il Gran Maestro, il Gran Commendatore, il Gran Connestabile, l'Ammiraglio, il Gran Priore, il Gran Cancelliere, il Tesoriere Generale ed il Priore della Chiesa, con l'elezione nella domenica in albis.

Nel 1737, estintasi la Casa dei Medici, con il Granduca Gian Gastone, la corona passò agli Absburgo che posero a Sovrano, Francesco Stefano di Lorena, marito di Maria Teresa d'Austria.

Le navi stefaniane compirono le loro ultime missioni navali contro gruppi di pirati nel 1774.

Il Granduca Leopoldo, nel 1775, soppresse la marina stefaniana e volse l'Ordine agli studi ed alle bonifiche della Maremma.

Con l'occupazione del Granducato di Toscana da parte delle truppe napoleoniche, il 9 febbraio 1801, Ferdinando III dovette abdicare. Napoleone, al suo posto, insediò Ludovico I di Borbone - Parma , che assunse anche il Gran Magistero dell'Ordine Stefaniano.

Il successivo 9 aprile 1809, con decreto di Napoleone, l'Ordine venne soppresso e confiscato dei suoi numerosi beni.

Con la fine dell'epopea napoleonica, nel 1814, Ferdinando III di Lorena ritornò nel Granducato e con motu proprio del 15 agosto 1815, ripristinò l'Ordine Stefaniano riformandolo con successivo decreto del 22 dicembre 1817.

L'Ordine ebbe quindi quattro classi:

I Cavalieri si dividevano a loro volta in Cavalieri di Giustizia ed in cavalieri di Grazia.

Il 16 novembre 1859, con la formazione del Governo Provvisorio della Toscana, l'Ordine verrà nuovamente soppresso, ma gli studiosi hanno più volte richiamata l'attenzione sulla incompetenza del Governo Provvisorio di Toscana a sopprimere un Ordine , sanzionato dinastico, da Bolle della Santa Sede.

Per quanto sopra i discendenti dell' ultimo Granduca di Toscana hanno continuato, seppur in casi limitatissimi, a conferire l'onorificenza di Cavaliere dell'Ordine di Santo Stefano papa e Martire.

Sua Altezza Imperiale e Reale l'Arciduca Leopoldo d'Absburgo Lorena di Toscana, in data 23 gennaio 1993, ha riformato gli Statuti dell'Ordine, che attualmente risulta diviso nelle seguenti classi:

Per la ricezione nell'Ordine nelle classi di Cavaliere e Dama, necessitano i seguenti requisiti:

Sua Altezza Imperiale e Reale l'Arciduca Sigismondo d' Absburgo Lorena di Toscana, dal 1994, è il nuovo Gran Maestro dell'Ordine Stefaniano.

La decorazione si compone di una croce ottagona , orlata d'oro, smaltata di rosso, accantonata da gigli d'oro, sormontata dalla corona reale.

Il nastro è di rosso fuoco.

E' opportuno infine ricordare che esiste l'Istituzione dei Cavalieri di Santo Stefano Papa e Martire